CRISPR-kutting av et plasmid med tre ulike gRNA
Lov på eksamen
- Kalkulator
- CAS
- Graftegner og regneark
- Lærebok, formelsamling og egne notater
Ikke åpent internett, kommunikasjon med andre eller kunstig intelligens.
Kan den løses uten PC?
Alle deloppgavene kan løses uten PC.
Fra 2027 er det bare kalkulator og skriftlige hjelpemidler på del 2. Vurderingen er gjort med KI og kan inneholde feil.
Lest inn av KI og ikke kontrollert manuelt enda — kan inneholde feil.
Metoden kalt CRISPR går ut på at et enzym (Cas9-enzymet) kutter begge trådene i et DNA-molekyl. Et kunstig laget RNA-molekyl (guide RNA eller gRNA) har på forhånd bundet seg til sekvensen på DNA, og molekylet viser hvor enzymet Cas9 skal kutte.
Figur 1 viser hvordan DNA blir kuttet med CRISPR-metoden.
Hvilken baserekkefølge har et gRNA-molekyl som kan gjenkjenne DNA-sekvensen ATGCCGTAGGT?
Beskriv én likhet og én forskjell mellom CRISPR-metoden og bruk av restriksjonsenzymer.
Noen forskere brukte CRISPR-metoden i et forsøk. De hadde tre reagensglass med følgende innhold:
- Et plasmid fra E-coli med kjent baserekkefølge
- Cas9-enzym
- Restriksjonsenzym A
- Tre ulike gRNA-molekyler (gRNA1, gRNA2 eller gRNA3) som er komplementære med hver sin sekvens i plasmidet fra E-coli
Den eneste forskjellen mellom de tre reagensglassene var altså at gRNA-molekylene var ulike, som vist i figur 2.
Produktene fra de tre reagensglassene ble kjørt i en gelelektroforese. Tegn en figur av en gel som viser resultatet fra denne gelelektroforesen. Skriv en figurtekst der du forklarer resultatet.
Fasit
UACGGCAUCCA
Likhet: begge kutter begge trådene i DNA-molekylet på et sted som er bestemt av baserekkefølgen. Forskjell: restriksjonsenzymet gjenkjenner selv en kort, fast sekvens, mens Cas9 kutter der gRNA-molekylet binder seg, og gRNA kan forskerne lage selv.
Alle tre plasmidene blir kuttet to steder og gir to fragmenter, og summen av fragmentene er like stor i alle tre glassene. Avstanden mellom kuttestedene er størst i reagensglass 1 og minst i reagensglass 3, så det minste fragmentet er størst i glass 1 og har vandret kortest, og minst i glass 3 og har vandret lengst.
LøsningsforslagKI-generert
Et gRNA-molekyl kjenner igjen DNA-sekvensen ved komplementær baseparing. RNA har uracil (U) der DNA har tymin (T).
Basene pares slik: A i DNA mot U i RNA, T mot A, G mot C og C mot G.
| DNA | A | T | G | C | C | G | T | A | G | G | T |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| gRNA | U | A | C | G | G | C | A | U | C | C | A |
gRNA-molekylet har altså baserekkefølgen UACGGCAUCCA.
Likhet. Både restriksjonsenzymer og Cas9 er enzymer som kutter begge trådene i et DNA-molekyl. Begge kutter på et bestemt sted som er bestemt av baserekkefølgen i DNA-et, og begge brukes i genteknologi til å klippe ut eller sette inn DNA-biter.
Forskjell. Et restriksjonsenzym gjenkjenner selv en kort, fast sekvens på omtrent fire til åtte baser. Skal du kutte et bestemt sted, må du finne et enzym som tilfeldigvis har gjenkjenningssekvensen sin akkurat der, og enzymet kutter alle steder i DNA-et der denne sekvensen finnes. I CRISPR-metoden brukes det samme enzymet, Cas9, hver gang, og det er gRNA-molekylet som bestemmer hvor kuttet skal skje. gRNA-et lager forskerne selv, og fordi sekvensen det binder seg til er mye lengre, treffer CRISPR ett bestemt sted. Metoden kan derfor rettes mot nesten hvilken som helst sekvens.
I hvert reagensglass blir plasmidet kuttet på to steder: ett kutt av restriksjonsenzym A og ett kutt av Cas9 der gRNA-molekylet har bundet seg. Et ringformet plasmid som blir kuttet to steder, blir til to lineære fragmenter. Alle tre glassene gir derfor to bånd på gelen.
Setet for restriksjonsenzym A ligger på samme sted i alle tre plasmidene, mens bindingsstedet for gRNA ligger ulikt. Avstanden mellom de to kuttestedene er størst i reagensglass 1 og minst i reagensglass 3. Det korteste fragmentet blir derfor størst i glass 1 og minst i glass 3, og det lengste fragmentet blir tilsvarende kortest i glass 1 og lengst i glass 3.
Plasmidet er like langt i alle tre glassene. Summen av de to fragmentene er derfor lik i alle tre brønnene.
DNA er negativt ladd og vandrer mot den positive polen i gelen. Små fragmenter kommer lettest gjennom porene i gelen og vandrer lengst, mens store fragmenter blir liggende nær brønnen.
